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絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)品如何制作?
  • 更新日期:2024-08-29      瀏覽次數(shù):343
    • 說(shuō)到標(biāo)準(zhǔn)品,我們先說(shuō)說(shuō)絕對(duì)定量:絕對(duì)定量是指在實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中,對(duì)已知量的樣本進(jìn)行連續(xù)稀釋后擴(kuò)增,生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后通過(guò)與此曲線比較,定量未知樣本,絕對(duì)定量可測(cè)定靶點(diǎn)的實(shí)際拷貝數(shù)。包括以下三個(gè)步驟:

      (1)將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度,作為模板進(jìn)行擴(kuò)增;

      (2)以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),以測(cè)得的Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;

      (3)根據(jù)未知樣品的Ct值,即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得樣品的拷貝數(shù)。

      以上可以看出標(biāo)準(zhǔn)品之于絕對(duì)定量是非常非常重要的,那么標(biāo)準(zhǔn)品該怎樣選擇?

      在GB/T22554-2010《基于標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性校準(zhǔn)》中注明標(biāo)準(zhǔn)樣品的組分需要與被測(cè)樣品組分一致。


      標(biāo)準(zhǔn)品 既可以是含有目的基因的線性化質(zhì)粒DNA,也可以是比目的基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)的純化后的PCR產(chǎn)物,或者基因組DNA和cDNA,但是需要作為標(biāo)準(zhǔn)品的核酸必須保證穩(wěn)定并且需要精準(zhǔn)定量。并且由于核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄等實(shí)驗(yàn)過(guò)程可能會(huì)影響反應(yīng)結(jié)果,所以需要注意標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)驗(yàn)步驟應(yīng)與實(shí)驗(yàn)樣品盡可能相同。常用標(biāo)準(zhǔn)品包括:


      DNA標(biāo)準(zhǔn)品

      純化的PCR擴(kuò)增片段或含有目的基因的克隆質(zhì)粒。

      優(yōu)點(diǎn):易制備,儲(chǔ)存穩(wěn)定;

      缺點(diǎn):缺少逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過(guò)程。


      RNA標(biāo)準(zhǔn)品

      目的基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA。

      優(yōu)點(diǎn):結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過(guò)程;

      缺點(diǎn):制備時(shí)間長(zhǎng),不穩(wěn)定。


      標(biāo)準(zhǔn)品的制備流程

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